銀離子對大腸埃-希桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌作用機理研究
中國清華大學材料工程和科學系 Q. L. Feng J. wu F. Z. Cui.
中國清華大學生物科學和生物工程系 G. Q. Chen
韓國Paichai 大學先進材料工程系 T. V. Kim. J. O. Kim.
1999.4.30提交,2000.3.1修改,2000,3.9接受。
摘要:
為了了解銀離子對微生物抑制的機理,用硝酸銀對被稱作G-的大腸桿菌(Escherichia coli )和G+的金黃色葡萄球菌(S.aureus)的兩種菌株進行處理。研究中使用了聯合電子顯微鏡和X—線微分析方法。
在經過Ag+的作用后,大腸桿菌和金葡菌細胞發生了相同的形態學改變。細胞漿膜從細胞壁上分離開來,在細胞中央出現了明顯的電子—光區域,它包括了致密的DNA分子。有很多小的電子密度結節圍繞在細胞壁周圍或沉淀在細胞內,X—線微分析檢測到電子密度結節和胞漿內有銀和硫元素的存在。這揭示出銀的抗菌機理:Ag+的作用使DNA 失去它的復制能力并且導致蛋白質的失活。金葡球菌的形態學改變較大腸桿菌輕微,意味著金葡球菌對銀離子的抑菌作用有抵抗作用。
關鍵詞:銀離子、抗菌機理、DNA分子、形態學改變、電子顯微鏡
引言
銀離子具有廣譜的、強大的抑菌作用已久為人知,銀的一些形態已被引入用來有效治療燒傷、嚴重的慢性骨髓炎、尿道感染和中心靜脈導管感染等疾病。
在我們以前的一項工作中,抗菌陶瓷已成功制造出來。那是以羥磷灰石(HA)為基材,加入硝酸銀后用濕化學過程完成的。它證明了羥磷灰石涂層中的植入材料用銀處理后,顯示出優秀的抗菌作用。也有報告稱,把Ag + 放入有許多微小孔隙的HA涂層,可以作為生命活性物質傳遞系統,可以緩慢釋放抗菌物質。一些方案已被發展為解釋Ag +的抑菌效果。一般認為,重金屬通過與SH基的結合與蛋白質起反應。這導致蛋白質的失活。最近的微生物學和化學試驗揭示Ag +與巰基相互作用,在滅活細菌的過程中扮演了一個基本的角色,揭示大量的銀在有氧的多水的介質中,催化了微生物的氧化過程導致它們完全毀滅。銀和過氧化氫共同作用影響大腸桿菌的生存。Ag和過氧化氫的聯合的毒性作用可能損壞了細胞的蛋白質。銀離子的抗微生物機理仍沒有全部被了解。Ag+ 對細菌的作用可能很復雜。然而對形態和結構的直接觀察,可以對了解銀的抗菌效應和抑菌過程提供有用的信息。
材料和方法
(略)
結果
Ag+處理后的大腸桿菌形態學改變。
圖1 顯示正常的大腸桿菌內部結構,清晰顯示細胞的電子密度在無外界環境的干擾時,細胞的正常狀態。DNA分子、電鏡下的電子-光物質 如圖1(b)箭頭所示,隨意分布在細胞內幾乎每個區域。
(圖2 )顯示加入Ag+后,E.Coli細胞顯著的形態學改變。圖2(a)是對銀作用細胞的總的情況。圖2(b)-(f)是放大后的觀察。銀作用后,顯著的電子-光區域經常出現在大腸埃-希菌的細胞中央圖2(a)箭頭所示。在電子-光區域的中央可以清楚地看到一些濃縮的物質,就像互相絞在一起的線,如圖2(b)箭頭所示。
銀處理過的大腸桿菌細胞漿膜和胞壁之間,出現了一個大的裂隙如圖2(c)。相比較于圖1的正常胞漿膜,銀離子的作用使得胞漿膜和胞壁分離開來。
圖2(d)箭頭處可以清楚地看到電子密度的結節圍繞著細胞壁。這些結節也存在于細胞漿中圖2(a)-(f)。但是電子-光區域內沒有電子密度結節。觀察到大量的電子密度結節圍繞在電子-光區域周圍,但卻不在這個區域內,這很有意思。這可能說明電子-光區域有防止電子密度結節進入的功能。與之相對比,在控制樣本內,未發現電子密度結節。
然而,圖2(e) 中可見相互矛盾的現象。觀察到細胞是由大量彌漫的、大的電子密度結節組成,而無電子-光區域和濃縮的DNA分子。在這種細胞中,沒有細胞壁。這種細胞就像是一個包含電子密度結節和胞漿的區域,可能是銀作用過的細胞將要死亡的特征形態。相同的情況只出現在與銀有關的物質中。
圖2(f)中看到在一些細胞中,細胞壁已被嚴重損壞了。在細胞內,有很多結節圍繞著電子-光區域。對小的電子密度結節和電子-光區域外的胞漿進行X-線微分析,顯示大量的銀和硫,說明銀離子進入細胞并與包括硫在內的一些元素結合。
討論:
用銀處理金葡菌和大腸桿菌后,發生了相同的現象,即:胞漿膜皺縮或從胞壁分離,在細胞中央出現電子-光區域,DNA分子位于這個區域的中央。在細胞內可以檢測到銀離子。所有這些現象說明銀離子攻擊細菌的可能的機理,和Gram陽性菌和Gram陰性菌-抵御銀離子攻擊的防御系統是一樣的。
DNA是細胞內最重要的遺傳信息,任何對—的損害都可導致機體的突變或死亡,自然情況下,細胞可以保護DNA分子免受侵害,電子-光區域如圖2(a)對DNA分子有這樣的保護功能。銀離子存在于電子密度結節內(圖3(a)),而在電子-光區域內幾乎沒有電子密度結節的現象,說明電子-光區域對DNA的保護功能。然而,直到現在,我們還不知道電子-光區域是如何形成的,并且在這區域內,除了DNA分子外,其他主要成分是什么。
Nover等人報告說,細胞為對抗有害的熱刺激,會產生一些小分子蛋白質,并且在細胞核的周圍聚集起來。雖然熱刺激與銀離子對細胞的影響不同,但這些都是外部環境對微生物的侵害。所以,當遭受銀離子攻擊后,細胞產生刺激蛋白,聚集在細胞核周圍保護DNA分子是可能的。如圖2(b)然而如果攻擊非常強烈,以致這種應激反應來不及有效發揮作用,電子-光區域或甚至是細胞壁就會毀壞,并且電子密度結節就會充滿細胞。如圖2(e)
現在知道DNA分子僅僅在放松的狀態下才能有效地進行復制,在濃縮狀態下,DNA分子就會失去這種復制能力,這已在目前的實驗中被證實了。把銀處理過的細胞移到新鮮的液態—培養基中繼續培養,細胞不能生長和繁殖。這個實驗說明銀離子抗菌作用的機理可能是:DNA的濃縮狀態失去了復制的能力。
硫在EDAX譜中的存在支持銀離子抗菌作用的另一個機理:銀與蛋白質上的巰基結合,使酶失活。巰基是酶有活性的一個重要基團。有報告說,重金屬通過與巰基結合使蛋白質失活。另一方面,銀是一種可以使蛋白質沉淀的重金屬。所以,銀進入細菌細胞,可以導致蛋白質在細胞內沉淀。考慮到這些,那么在電子-光區域外的電子密度結節應該是銀和蛋白質沉淀物的復合物。
金葡菌形態改變較輕微,可能是由于它的結構特征。Gram+和Gram-菌細胞的細胞壁有顯著不同。很明顯,Gram+菌細胞壁的多肽比Gram-菌厚的多。金葡菌更厚的胞壁在保護細胞不讓銀離子進入胞漿方面,起了很大作用。
目前的研究,給出了抗微生物植入物實際應用的一些建議。只有當銀離子可以從植入物中釋放出來才有抗菌效果。釋放出的銀離子穿透細胞壁進入細胞,結果使得DNA分子成為濃縮狀態,同時與蛋白質發生反應。所有這些導致微生物損害或死亡。見圖2
結論:
比較了銀離子對大腸桿菌和金葡菌的影響結果,我們發現:
1, 細胞內電子-光區域中央DNA由自由狀態變成濃縮狀態。
2, 在細胞壁或電子-光區域周圍出現電子密度結節。
3, X-線微分析顯示銀存在于電子密度結節、細胞漿和DNA分子中。
以上結果引出關于銀離子對大腸桿菌和金葡菌的抗菌機理的結論:
1, 銀離子有致細胞變性的作用,作為對抗這種作用的一種反應,DNA分子成為濃縮狀態并失去其復制能力
2, 銀離子與蛋白質上的巰基相互作用,導致細菌蛋白質的失活。